Στη διαδικασία διεξαγωγής γενετικών μελετών, συναντάμε συχνά ανεπαρκή δείγματα RNA, για παράδειγμα, για τη μελέτη μικροσκοπικών ανατομικών στοματικών όγκων, ακόμη και δειγμάτων μονοκυττάρου, και δείγματα συγκεκριμένων γονιδιακών μεταλλάξεων που μεταγράφονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε ανθρώπινα κύτταρα.Φυσικά, για το τεστ COVID-19, εάν τα επιχρίσματα δεν είναι στη σωστή θέση ή δεν είναι αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας, το μέγεθος του δείγματος θα είναι πολύ χαμηλό, γι' αυτό και η Επιτροπή Υγείας και Οικογενειακού Προγραμματισμού βγήκε πριν από δύο ημέρες και πέρασε το τεστ και αν ο δειγματολήπτης νουκλεϊκού οξέος δεν πήρε έξι δείγματα, μπορείτε να το αναφέρετε.
Η ευαισθησία του αντιδραστηρίου είναι σημαντική επειδή έχουμε αυτό ή εκείνο το πρόβλημα, οπότε τι μπορούμε να κάνουμε για να βελτιώσουμε την ευαισθησία της RT-PCR;
Πριν συζητήσουμε πιθανές λύσεις, ας αναφέρουμε δύο μεγάλες επιπλοκές με την κατάσταση που μόλις αναφέραμε.
Πρώτα απ 'όλα, ανησυχούμε για την απώλεια RNA όταν έχουμε μόνο λίγους κυτταρικούς πληθυσμούς στο δείγμα μας.Εάν χρησιμοποιηθούν παραδοσιακές μέθοδοι διαχωρισμού και καθαρισμού, όπως μέθοδος στήλης ή μέθοδος καθίζησης νουκλεϊκού οξέος, υπάρχει μεγάλη πιθανότητα να χαθούν τα λίγα δείγματα.Μια λύση είναι να προσθέσουμε ένα μόριο φορέα, όπως το tRNA, αλλά ακόμη και τότε, δεν υπάρχει καμία εγγύηση ότι το πείραμά μας ανάκτησης είναι εντάξει.
Τι καλύτερο λοιπόν;Μια καλή επιλογή για καλλιεργημένα κύτταρα ή μικροανατομικά δείγματα είναι η χρήση άμεσης λύσης.
Η ιδέα είναι να χωριστούν τα κύτταρα για 5 λεπτά, να απελευθερωθεί το RNA στο διάλυμα, στη συνέχεια να σταματήσει η αντίδραση για 2 λεπτά, στη συνέχεια να προστεθεί το προϊόν λύσης απευθείας στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής έτσι ώστε να μην χαθεί κανένα RNA και τελικά να τοποθετηθεί το cDNA που προκύπτει απευθείας στην αντίδραση σε πραγματικό χρόνο.
Τι γίνεται όμως αν, λόγω ενός περιορισμένου σημείου εκκίνησης ή μιας μικρής ποσότητας έκφρασης γονιδίου στόχου, μπορούμε να ανακυκλώσουμε όλο το RNA και παρόλα αυτά να μην παρέχουμε αρκετά πρότυπα για να λάβουμε ένα καλό σήμα σε πραγματικό χρόνο;
Σε αυτή την περίπτωση, το βήμα προενίσχυσης μπορεί να είναι πολύ χρήσιμο.
Το παρακάτω είναι ένα σχήμα για την αύξηση της ευαισθησίας μετά την αντίστροφη μεταγραφή.Πριν ξεκινήσουμε, πρέπει να ρωτήσουμε κατάντη ποιοι στόχοι μας ενδιαφέρουν, ώστε να σχεδιάσουμε συγκεκριμένους εκκινητές για αυτούς τους στόχους για προενίσχυση.
Αυτό μπορεί να επιτευχθεί δημιουργώντας ένα μικτό αστάρι με έως και 100 ζεύγη εκκινητών και έναν κύκλο αντίδρασης 10 έως 14 φορές.Επομένως, απαιτείται ένα Master Mix ειδικά σχεδιασμένο για αυτήν την απαίτηση για την προενίσχυση του cDNA που λαμβάνεται.
Ο λόγος για τον ορισμό του αριθμού των κύκλων μεταξύ 10 και 14 είναι ότι αυτός ο περιορισμένος αριθμός κύκλων διασφαλίζει την τυχαιότητα μεταξύ των διαφόρων στόχων, κάτι που είναι κρίσιμο για τους ερευνητές που χρειάζονται ποσοτικές μοριακές πληροφορίες.
Μετά την προενίσχυση, μπορούμε να πάρουμε μεγάλη ποσότητα cDNA, έτσι ώστε η ευαισθησία ανίχνευσης στο back-end να βελτιωθεί σημαντικά και να αραιώσουμε το δείγμα και να εκτελέσουμε πολλαπλές αντιδράσεις PCR σε πραγματικό χρόνο για να εξαλείψουμε πιθανά τυχαία σφάλματα.
Ώρα δημοσίευσης: Απρ-11-2023